品質科学 No.8 タンパク質 Part8(タンパク質の定量法）
やっほみんな息してる？
この前も言ったけど最近バイトに落ちまくってほんとにやばい金欠大学生おにぎりです！
いやまじでやばい
9月に免許取りに行くけどそれまでにうん10万なんて貯められる気がしなくなってきた
何がタチ悪いって面接してるとき、し終わった後はすごい感触がいいってこと
その感触を味わいながら何個のバイトに落ちただろう笑
金曜日にも面接あるけどどうなるんだろう
どうかお願いしますm(._.)m
今回はタンパク質の定量法について書いていくよ
そいじゃあれっつごー٩( 'ω' )و
タンパク質成分の一括定量法
まずタンパク質成分を一括して定量する方法は絶対的測定法と相対的測定法の2つがあるよ
まずはこれら2つが何かについて書いていくよ
絶対的測定法
絶対的測定法っていうのは目的のタンパク質と同じ種類や同じ構造の標準物質を必要としない方法だよ
これに属するのは下の3つの測定法だよ
・分離秤量法
・ケルダール法
・紫外線吸収測定法
相対的測定法
相対的測定法というのは絶対的測定法とは逆に標準物質を必要とする測定法だよ
これに属するのは下の3つの測定法だよ
・ビウレット法
・BCA法
・色素結合法
ここからはここの測定法について詳しく書いていくよ
ケルダール法
原理
これはタンパク質中の窒素の量を求める方法だよ
タンパク質中の窒素含量がほぼ一定（14-19%）であることを利用し、硫酸と強熱して、タンパク質中の窒素を全部硫酸アンモニウムにしてその後塩基性条件下にして加熱することでアンモニアを発生させそのアンモニア量から窒素の量を求めるよ
長所
動植物の組織、器官や食品などの比較的複雑な構造、組成を持つ試料でも定量が可能だよ
他にも試料の量を多くすることで得られる値のばらつきを小さくすることも可能だよ
短所
非タンパク質性の窒素の除去が必要となることがあるよ
例えば食品にはタンパク質以外の窒素化合物としてアミド類やプリン塩基類のものがあってそういうのも一緒に定量すると実際のタンパク質の窒素含有量より大きい値を取ることになるよ
他にも定量操作が煩雑で時間がかかったり加えて有害な試薬を使用しているというのもあげられるよ
だから場合によっては高校生はお馴染みのデュマ法を使ったりすることもあるよ
あと感度はあんまり高くないよ
つまり微量の窒素を測定するのは向いてないよ
ビウレット法
原理
これは高校生お馴染みのビウレット反応を使った定量法だよ
2つ以上のペプチド結合が接近して存在するときに強アルカリ性側で銅イオン（Ⅱ）と錯体を形成し銅イオンが還元されることで発色を行う点を利用しているよ
測定波長は540 nm
定量範囲は5 mg-160 mg/mL
長所
タンパク質の単位質量あたりのペプチド結合数はタンパク質の種類によって大差ないからタンパク質の種類が違っても発色率があまり変動しないよ
短所
定量範囲の関係から感度があまり高くなくて、低濃度の試料の測定には向いていないよ
トリス緩衝液、スクロース、アンモニウムイオンなどは発色に影響を与えて測定誤差を生む妨害物質になるよ
BCA法
原理
ビウレット法を改良したものにローリー法ってのがあるんだけどそのローリー法をさらに改良したのがこのBCA法だよ
BCA法は銅イオン（Ⅱ）が錯体を形成し銅イオン（Ⅰ）に還元された後ビシンコニン酸（BCA）を添加して2分子BCAを銅イオンに配位させることで青紫色に発色する錯体を作るよ
測定波長は562 nm
長所
定量範囲が1-2000 μg/mL で広い範囲で直線性を示すよ
加えて測定が簡単で検出感度が高いよ
ビウレット法と同じくタンパク質間の発色率の差が小さいよ
短所
キレート試薬や還元剤が妨害試薬になったりするよ
色素結合法（Bradford法）
原理
トリフェニルメタン系色素のCoomassie Brilliant Blue G-250（CBB G-250）とタンパク質中のアルギニン残基と芳香族アミノ酸残基の側鎖と結合することによって最大の吸収波長が465 nmから595 nmにシフトするのを利用した定量法だよ
色が赤紫色から青色に変化して吸光度に変化が生まれるところから測定するよ
定量範囲は10-2000μg/mL
長所
タンパク質とCBB G-250の入った混合液を1分くらい静置するだけだから測定がすごい簡単だよ
他にも今まで上げてきた妨害物質の影響はほとんど受けないよ
短所
界面活性剤の影響を受けてタンパク質のアミノ酸組成に影響を受けるよ
紫外線吸収スペクトル法
原理
芳香族アミノ酸含量が大きく変動しない点に着目して芳香族アミノ酸が280 nm付近の紫外光を吸収する性質を利用しタンパク質の280 nm付近の吸光度を測定する定量法だよ
長所
試薬が入らなくて測定が簡単だよ
さらに測定後にサンプルを回収することができるよ
短所
今まであげてきた他の定量法に比べて感度が低いよ
タンパク質の種類によって吸光度に差が出るよ
280 nmに吸収を持たないタンパク質、例えばゼラチンやコラーゲンは測定できないよ
タンパク質以外に280 nm付近に光吸収を持つ物質がいたらその影響をもろに受けるよ、例えば核酸や芳香族アミノ酸があるよ
他にも蛍光光度法や抗体による検出などもあるよ
蛍光光度法はタンパク質の第一級アミンとの結合によって蛍光を発色する試薬を用いて定量することがあるよ
抗体による検出の例としてはウエスタンブロットがあるよ
今回はこの辺で終わるよ
やっとタンパク質について書くのの折り返し地点にきたよ
まじでもう疲れた笑
いつものようになんか間違いがあったら教えてね
ではでは〜
